Il Colosseo ospitava i giochi dell'anfiteatro, che comprendevano: lotte tra animali (venationes), l'uccisione di condannati da parte di animali feroci o altri tipi di esecuzioni (noxii) e i combattimenti tra gladiatori (munera). Le attività seguivano un programma codificato: la mattina c'erano i combattimenti fra gli animali o fra un gladiatore e un animale, all'ora di pranzo si eseguivano le condanne a morte e solo nel pomeriggio si svolgevano i combattimenti fra gladiatori.
Per l'inaugurazione dell'edificio, l'imperatore Tito diede dei giochi che durarono tre mesi, durante i quali morirono circa 2.000 gladiatori e 9.000 animali. Per celebrare il trionfo di Traiano sui Daci vi combatterono 10.000 gladiatori.
Gli ultimi combattimenti tra gladiatori sono testimoniati nel 437, ma l'anfiteatro fu ancora utilizzato per le venationes (uccisione di animali) fino al regno di Teodorico il Grande: le ultime vennero organizzate nel 519, in occasione del consolato di Eutarico (genero di Teodorico), e nel 523, per il consolato di Anicio Ma**imo.
Nella cultura popolare
In una puntata del cartone animato I Flinstones dove le 2 famiglie protagoniste viaggiano nel tempo, Fred e Barney finiscono nell'arena rischiando di finire sbranati dai leoni mentre l' imperatore (probabilmente Nerone) suona il violino rimproverando Wilma e Betty che insistono per riavere indietro i mariti.
Quando qualcuno entra da una porta senza richiuderla, è un detto molto diffuso chiedere "ma che abiti al colosseo?" in quanto la costruzione attualmente non possiede porte e finestre...